常見問題

可能原因

解決方法

陽性對照、待測樣本均無條帶。

PCR反應(yīng)體系或反應(yīng)條件不合適。

使用梯度PCR摸索PCR反應(yīng)條件。

PCR試劑保存不當(dāng)失去活性。

2× PCR Mix應(yīng)保存于-20℃，使用時(shí)避免反復(fù)凍融。若使用頻繁，可在4℃短時(shí)間存放。

引物設(shè)計(jì)問題。

嘗試重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢查。

陽性對照有目的條帶，待測樣本無條帶或條帶弱。

不當(dāng)儲存或長期儲存引起試劑活性喪失。

使用新鮮的試劑。

加入組織裂解液過量。

增大反應(yīng)體系，或減少裂解液的用量。

樣本裂解混合液保存不當(dāng)或保存時(shí)間過久，DNA基因組已經(jīng)降解。

裂解混合液液可在4℃保存2-3天，盡量使用新制備的裂解液混合液進(jìn)行PCR。

模板加入量不適合。

在反應(yīng)體系10-20%范圍內(nèi)優(yōu)化模板加入量。反應(yīng)效性能較差時(shí)，可以降模板濃度調(diào)節(jié)到低于10%的范圍。

PCR循環(huán)數(shù)不足。

適當(dāng)增加PCR的循環(huán)數(shù)，推薦在35-40循環(huán)為佳。因?yàn)槟０鍙?fù)雜，一般PCR反應(yīng)要比用純化的 DNA模板多5-10個(gè)循環(huán)為佳。

非特異性擴(kuò)增

PCR退火溫度太低，循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度太高。

增加PCR退火溫度，降低PCR循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度。

PCR引物錯(cuò)配。

重新設(shè)計(jì)PCR引物。

配制PCR反應(yīng)體系時(shí)溫度太高或配制完成后放置時(shí)間太久。

PCR反應(yīng)體系的配制在低溫下進(jìn)行，配制完成后盡快進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

陰性對照出現(xiàn)目的條帶

操作工具或試劑污染。

實(shí)驗(yàn)所有試劑或器材均應(yīng)高壓滅菌。操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。

樣本間交叉污染。

每個(gè)取樣器只對一個(gè)樣本使用；或取完一個(gè)樣本后，將取樣器刃口浸入2%的次氯酸鈉溶液中，反復(fù)涮洗，然后用干凈的紙巾擦干殘液。