原代培養(yǎng)的基本過程包括取材、 培養(yǎng)材料的制備、 接種及培養(yǎng)等步驟，原代培養(yǎng)的方法很多，基本和常用的是組織塊培養(yǎng)法和分離細胞法。

1)用培養(yǎng)液濕潤所取組織材料，并用鋒利的眼科剪將附在其上的脂肪和結(jié)締組織去除干凈。再用平衡液 (PBS )或 Hanks 液漂洗; 用鋒利的眼科彎剪將組織塊剪成小塊; 再用 PBS或 Hanks 液漂洗多次，直至液體不渾濁、無油滴、清亮為止。

2)用濕潤的吸管吸取切碎的組織塊，輕輕吹到培養(yǎng)瓶皿中，并將其按一定間距均勻放在培養(yǎng)瓶底壁上，量不要過多，要將組織塊切面貼在培養(yǎng)瓶底壁上。

3)將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，使瓶底朝上，在種植了組織塊一側(cè)的對側(cè)面加足培養(yǎng)液，勿使組織塊與培養(yǎng)液接觸，塞緊瓶塞。

4)將種植了組織塊的一側(cè)朝上，靜置于 37℃培養(yǎng)箱中;待組織塊貼壁 1h 到 3h 后翻瓶，使貼壁的組織塊浸沒與培養(yǎng)液中，靜置。

5)每隔 2 到 3 天更換一次培養(yǎng)液，或者根據(jù)培養(yǎng)瓶種顏色的變化確定換液時間。

1)剛接種后，組織塊粘附不牢固，觀察和轉(zhuǎn)移過程中動作要輕，以防引起液體振蕩，使組織塊漂起。

2)培養(yǎng)初期，要注意觀察有無細菌、霉菌污染。

3)原代培養(yǎng)要及時觀察，記錄。

4)過3-5天，需要換液以除去漂浮組織塊和殘留的血細胞，保證原代細胞正常生長。

1)首先用細胞分散法收獲細胞，隨時吸取少量消化液在鏡下觀察，并根據(jù)組織是否分散成細胞團或單個細胞，采取終止消化措施。用篩網(wǎng)濾掉未消化的組織塊。

2)低速離心細胞懸液，棄掉上清液，加入含血清的培養(yǎng)液，輕輕吹打制成細胞懸液，計數(shù)并用培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度。

3)根據(jù)培養(yǎng)的細胞類型和實驗要求，用吸管吸取一定量的細胞懸液，加到培養(yǎng)瓶中。對于需要特殊底物的細胞，要先將底物涂一層于培養(yǎng)瓶皿底壁，然后接種細胞。

4)將培養(yǎng)瓶放入 37℃恒溫箱中培養(yǎng)。

5)每隔 2 到 3 天更換培養(yǎng)液一次或根據(jù)培養(yǎng)液顏色的變化確定換液時間。

1)原代培養(yǎng)的分離細胞在初次接觸體外環(huán)境時，雖然被分散成單個細胞，但它們之間的互相影響還是存在的， 而且這種影響對細胞能否存活是非常重要的。在這些細胞之間能產(chǎn)生一些促生長的活性物質(zhì)， 使細胞彼此互相促進存活和生長。如果接種的細胞密度過低， 細胞之間的促生長作用很小， 雖然營養(yǎng)物質(zhì)很充足， 也很難使細胞適應(yīng)從體內(nèi)的組織環(huán)境到被分散后進入獨立生存環(huán)境的變化過程。 如果接種的細胞密度過大，會導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足， 代謝廢物積累較快需要經(jīng)常換液和傳代。

2)原代培養(yǎng)時初始培養(yǎng)在組織分散和分離細胞時細胞可能會受到嚴(yán)重的損傷。適當(dāng)增大原代培養(yǎng)接種的細胞密度， 給培養(yǎng)的細胞提供更多的類似于在體內(nèi)時細胞之間的相互作用， 會極大提高原代培養(yǎng)的細胞在體外存活率。待細胞適應(yīng)體外環(huán)境后進行傳代培養(yǎng)時再以較低的密度接種和培養(yǎng)。

3)由于細胞之間的相互的內(nèi)在聯(lián)系被打破，分離細胞在體外培養(yǎng)時經(jīng)歷的生存環(huán)境改變很大，在體外存活和生長的難度相應(yīng)增加。 對于貼壁依賴性細胞來說，盡快使接種的細胞貼壁，是決定培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵?？梢栽诮臃N后先將培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 3h 到 5h，由于細胞懸液中帶有少量培養(yǎng)液， 細胞即可以維持存活， 又可以很快接觸到培養(yǎng)瓶底壁， 是細胞迅速黏附于底物，待細胞貼壁后，再補足培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1)制備細胞懸濁液，計數(shù)并用培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度。

2)在培養(yǎng)皿中加入足夠的培養(yǎng)液。

3)將欲接種的細胞接種到培養(yǎng)器皿中。

4)在培養(yǎng)皿內(nèi)放入一個有聚四氟乙烯包被的磁棒。將培養(yǎng)皿封口，送入恒溫箱內(nèi)。在磁力攪拌器上邊攪拌邊培養(yǎng)。若接種培養(yǎng)瓶或試管中，封口后可將培養(yǎng)器皿固定在恒溫?fù)u床上，邊搖動邊培養(yǎng)，無需放置磁棒。有些細胞也可以不用磁棒或磁力攪拌器，也不必使用恒溫?fù)u床，接種于預(yù)先用硅脂包被的培養(yǎng)器皿內(nèi)直接在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)即可。

5)培養(yǎng)液略呈黃色換液。吸出部分舊培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液即可。

1)進行懸浮細胞培養(yǎng)時必須保持細胞的懸浮狀態(tài)?？梢酝ㄟ^增加培養(yǎng)液的黏度來幫助細胞呈懸浮狀態(tài)，如給培養(yǎng)液中加入低濃度的透明質(zhì)酸復(fù)合物。在有攪拌裝置的培養(yǎng)器皿內(nèi)加入培養(yǎng)液是，以 5ml 為限度，否則攪拌時會產(chǎn)生氣泡對細胞造成傷害。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過快， 否則即可使培養(yǎng)液溢出又容易造成污染。 如果培養(yǎng)液的量在 5ml 以下，可以采用旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。給懸浮培養(yǎng)的細胞換液時要注意不要吸出細胞。

2)能夠進行懸浮培養(yǎng)的細胞，其生命力一般都比較旺盛，體外分裂增殖的速度較快，營養(yǎng)成分消耗大，換液時間隔一般較短。

1）在原代培養(yǎng)的 1 天到 2 天內(nèi)，要特別注意觀察是否有細菌、真菌的污染，一旦發(fā)現(xiàn)，要及時清除，防止造成其它細胞的交叉感染；

2）隨著培養(yǎng)的進程，培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)被逐漸的消耗，營養(yǎng)成分越來越少，細胞代謝產(chǎn)物越來越多，有細胞呼吸過程中釋放出來的 CO 2 及其它產(chǎn)物如乳酸、丙酮酸等也逐漸增加。隨著酸性物質(zhì)的增加，培養(yǎng)液中的 pH值越來越低，培養(yǎng)液的顏色也越來越黃。因此，在細胞培養(yǎng)的過程中，要注意培養(yǎng)液顏色的變化，并根據(jù)培養(yǎng)液的顏色來決定換液時間。正常情況下，培養(yǎng)液呈桃紅色;當(dāng)培養(yǎng)液呈橙黃色時，細胞一般生長情況良好;呈淡黃色時，可能培養(yǎng)時間較長，營養(yǎng)不足，死亡細胞較多;呈紫紅色時， 可能是細胞生長狀態(tài)不好或已經(jīng)死亡。所以， 應(yīng)在培養(yǎng)液略黃時吸出部分舊培養(yǎng)液， 然后補加同等數(shù)量的新鮮培養(yǎng)液。換液過程中，不要吸出細胞，不要使培養(yǎng)液溢出培養(yǎng)瓶，避免各種微生物的污染。換液時，應(yīng)將培養(yǎng)液事先預(yù)溫至 37℃。

一般培養(yǎng)一天，組織細胞即可在培養(yǎng)瓶皿底壁黏附并貼壁生長。 2 天到 3 天后，細胞恢復(fù)增殖活動。隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量逐漸增多， 消耗的營養(yǎng)物越來越多， 需要換液的時間越來越短，當(dāng)細胞逐漸長滿培養(yǎng)瓶壁并形成一單層細胞時，細胞之間相互發(fā)生接觸和聯(lián)系，逐漸產(chǎn)生接觸抑制作用，培養(yǎng)物生長速度減慢。 當(dāng)培養(yǎng)物最后形成一層完整的細胞單層時，生長幾乎停止。在細胞高達 80%融合時就需要進行傳代了。

1)原代培養(yǎng)材料的選擇，盡量選取繁殖能力較強的組織，如胚胎、幼小的生物體或者腫瘤組織等。

2)要注意無菌操作。其操作要求應(yīng)高于外科手術(shù)

3)整個取材操作要迅速，尤其孕鼠浸泡乙醇時間1min左右，不能過長，以確保胚胎細胞活性。

4)運用消化法時Pancreatic enzymes溫度應(yīng)低于37℃，濃度只需平時消化細胞濃度的一半。因為此過程不像消化培養(yǎng)細胞時的1~10min，而是至少20min，先消化下來的細胞在此Pancreatic enzymes消化液中繼續(xù)消化了10min以上。所以Pancreatic enzymes不能作用過強，否則這些細胞易被損傷而不易生存。

5)如使用組織塊法，則應(yīng)待組織塊略干燥，能黏附于瓶壁時再使之與培養(yǎng)液接觸，匆使組織塊漂浮起來。如果組織塊沒有黏壁，則細胞不易生長，即使生長也因沒有貼在瓶壁上，從而因不能觀察到而無法收集到生長的細胞。

6)原代培養(yǎng)操作時，也可以使用未添加血清的DMEM或PBS洗滌子宮、胚胎或組織塊等。

7)本實驗也可以使用新生乳鼠做培養(yǎng)材料。此時要將乳鼠浸入75%乙醇2~3min使皮膚充分消毒，由于乳鼠原代培養(yǎng)污染概率更高，故應(yīng)小心操作，避免污染細菌。乳鼠原代培養(yǎng)細胞的存活率不及胚胎細胞培養(yǎng)的成功率。